絲狀噬菌體是一類常見(jiàn)的細(xì)菌病毒，其長(zhǎng)度約為1-2 μm，直徑約6-7 nm。絲狀噬菌體的衣殼包裹著一個(gè)環(huán)狀單鏈 DNA 基因組1。病毒粒子的長(zhǎng)度取決于其所包裝基因組的大小和拷貝數(shù)2。絲狀噬菌體的衣殼由數(shù)千個(gè)衣殼蛋白 pVIII 和僅有幾個(gè)拷貝的四個(gè)次要衣殼蛋白(包括 pIII，pVI，pVII 和 pIX)組裝而成3。與有尾烈性噬菌體不同，絲狀噬菌體從宿主細(xì)胞釋放通過(guò)一個(gè)類似于毒性因子分泌的過(guò)程，而不是通過(guò)裂解宿主細(xì)胞。盡管不同絲狀噬菌體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被廣泛研究，但是由于其奇特的外形，絲狀噬菌體次要衣殼蛋白在病毒組裝中的作用以及絲狀噬菌體基因組包裝的分子機(jī)制知之甚少。
2023年9月5日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院長(zhǎng)聘副教授，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心研究員，c7c7.app-清華大學(xué)前沿醫(yī)學(xué)研究中心研究員向燁課題組在《自然-通訊》（Nature communications）雜志在線發(fā)表了題為"Cryo-EM structure of a bacteriophage M13 mini variant"（噬菌體 M13迷你變異體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)）的研究論文，報(bào)道了噬菌體M13一個(gè)迷你粒子的衣殼及內(nèi)部ssDNA基因組結(jié)構(gòu)，該研究提供了絲狀噬菌體組裝的全新分子機(jī)制。
基于1992年Specthrie, L等人的實(shí)驗(yàn)方法4，向燁團(tuán)隊(duì)對(duì)M13的基因組進(jìn)行改造，并通過(guò)輔助噬菌體的幫助，成功表達(dá)出長(zhǎng)度約為50 nm的迷你M13噬菌體，并對(duì)其進(jìn)行冷凍電鏡結(jié)構(gòu)研究（圖1）。在冷凍電鏡數(shù)據(jù)分析中，應(yīng)用block based reconstruction方法5，得到噬菌體的中間部分和兩個(gè)末端的高分辨密度圖，建立了完整衣殼的原子模型（圖1）。通過(guò)對(duì)完整衣殼結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)M13迷你噬菌體的末端由兩個(gè)帽狀復(fù)合物密封，這兩個(gè)復(fù)合物由pVII，pIX，pIII和pVI這四種次衣殼蛋白組成。頂部帽復(fù)合物由 pVII 和 pIX 的五聚體組成，兩者都具有單一的螺旋結(jié)構(gòu)。頂部帽復(fù)合物內(nèi)側(cè)帶電荷的殘基，包括pVII 的Arg33和 pIX 的 Glu29，在空間上靠近內(nèi)部基因組的包裝信號(hào)區(qū)域。進(jìn)一步通過(guò)突變研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)氨基酸殘基在病毒組裝中起著關(guān)鍵作用。M13迷你噬菌體中間部分與前人研究結(jié)果類似，是一個(gè)由pVIII組成的螺旋桶裝結(jié)構(gòu)。第一層pVIII的曲度相較于中間部分的分子更大，其在頂部帽狀結(jié)構(gòu)和中間螺旋部分中起到過(guò)渡作用。M13迷你噬菌體底部的帽狀結(jié)構(gòu)由具有鉤狀結(jié)構(gòu)的pIII 和 pVI形成。PIII和pVI分子通過(guò)氫鍵和靜電相互作用交替分布在pVIII螺旋桶末端外，并在底部收緊形成一個(gè)筆尖樣結(jié)構(gòu)。在對(duì)最后三層pVIII形成的pIII結(jié)合口袋分析表明pIII 在噬菌體衣殼組裝末期可有效地與 pVIII 競(jìng)爭(zhēng)，從而終止基因組的包裝并幫助形成成熟的病毒粒子。
為了確定M13迷你噬菌體內(nèi)部 ssDNA 基因組的結(jié)構(gòu)，研究使用非對(duì)稱重構(gòu)方法對(duì)衣殼內(nèi)部ssDNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)ssDNA具有右手雙螺旋結(jié)構(gòu)（圖2A）。通過(guò)比較螺旋參數(shù)，M13迷你噬菌體內(nèi)部 ssDNA 基因組的螺旋結(jié)構(gòu)與A型dsDNA類似。這是研究者首次直接觀測(cè)到絲狀噬菌體環(huán)狀ssDNA結(jié)構(gòu)（圖2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)衣殼內(nèi)表面帶正電荷殘基的非對(duì)稱構(gòu)象對(duì)于穩(wěn)定內(nèi)部ssDNA結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵作用。
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院長(zhǎng)聘副教授，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心研究員，c7c7.app-清華大學(xué)前沿醫(yī)學(xué)研究中心研究員向燁為該論文的通訊作者，向燁課題組18級(jí)博士生賈麒為該論文的第一及唯一非通訊作者。清華醫(yī)學(xué)院已畢業(yè)的黃亮博士在冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集方面為本研究提供了幫助。清華大學(xué)藥學(xué)院張數(shù)一教授和武漢大學(xué)殷雷教授為本研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。中國(guó)科學(xué)院生物物理所章新政研究員對(duì)非對(duì)稱重構(gòu)提供了支持。清華大學(xué)中國(guó)蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京分中心）提供了設(shè)施支持。該項(xiàng)目研究獲得c7c7.app-清華大學(xué)前沿醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)科學(xué)技術(shù)部，清華大學(xué)萬(wàn)科公共衛(wèi)生與健康學(xué)科發(fā)展專項(xiàng)基金，國(guó)家自然科學(xué)基金，清華大學(xué)春風(fēng)計(jì)劃基金，北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心和北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖中心的資助。
https://www.nature.com/articles/s41467-023-41151-7
1. Rakonjac, J., Bennett, N. J., Spagnuolo, J., Gagic, D. & Russel, M. Filamentous bacteriophage: biology, phage display and nanotechnology applications. Curr Issues Mol Biol 13, 51-76 (2011).
2. Sattar, S. et al. Ff-nano, short functionalized nanorods derived from Ff (f1, fd, or M13) filamentous bacteriophage. Front Microbiol 6, 316 (2015). https://doi.org:10.3389/fmicb.2015.00316
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4. Specthrie, L. et al. Construction of a microphage variant of filamentous bacteriophage. J Mol Biol 228, 720-724 (1992). https://doi.org:10.1016/0022-2836(92)90858-h
5. Zhu, D. et al. Pushing the resolution limit by correcting the Ewald sphere effect in single-particle Cryo-EM reconstructions. Nat Commun 9, 1552 (2018). https://doi.org:10.1038/s41467-018-04051-9
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