黨參均一多糖CPA在Caco-2單層及小鼠體內(nèi)的入胞機(jī)制及轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)研究
黨參為桔？浦參锏巢 Codonopsis pilosula (Franch) Nannf、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf． var． modesta (Nannf) L.T.Shen 或川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功效。臨床主要用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥狀。作為大宗藥材，國(guó)內(nèi)黨參每年的消耗量約3.5噸。據(jù)2020版藥典記載，約10%的中藥方劑中含有黨參，可謂“無(wú)參不成方”。依據(jù)黨參的不同產(chǎn)區(qū)將黨參分為臺(tái)黨（山西五臺(tái)山），潞黨（山西長(zhǎng)治），東黨（中國(guó)東北），條黨（中國(guó)四川）。太行山位于華北平原和山西黃土高原之間，其特殊的地理位置和氣候條件，為黨參生長(zhǎng)提供了得天獨(dú)厚的生態(tài)優(yōu)勢(shì)，《本草從新》曾記載：“參須上黨者佳”，太行山所產(chǎn)潞黨參品質(zhì)極佳，被認(rèn)為是黨參的道地產(chǎn)區(qū)。
潞黨參為山西傳統(tǒng)道地藥材，多糖含量是反映潞黨參道地品質(zhì)的重要質(zhì)量指標(biāo)，而果聚糖是黨參多糖的主要成分，也是黨參的主要藥理活性物質(zhì)。課題組前期從黨參多糖中分離出菊粉型果聚糖CPA，核磁和TOF-MS結(jié)構(gòu)解析顯示CPA分子量約為3.6 KDa，聚合度為31，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黨參多糖CPA對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎、胃潰瘍等疾病有很好的干預(yù)作用，被認(rèn)為是一種植物來(lái)源的有廣闊應(yīng)用前景的新藥候選分子。但是，作為大分子多糖，CPA化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺少光吸收和光發(fā)色基團(tuán)，沒(méi)有特定的紫外吸收光譜，常規(guī)的檢測(cè)器難以對(duì)其檢測(cè)分析，很難在生物樣本中實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。課題組前期發(fā)現(xiàn)CPA在腸道組織中分布較少，CPA良好的治療作用與其吸收入胞有關(guān)嗎？CPA是否可以吸收入胞？是通過(guò)什么途徑進(jìn)入細(xì)胞的？等問(wèn)題尚不清楚。
因此，為明確CPA能否入胞及其機(jī)制研究，山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授團(tuán)隊(duì)，在Caco-2 細(xì)胞及小鼠體內(nèi)進(jìn)行了研究，首先選取臨床常用熒光染料異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）作為熒光劑對(duì)CPA進(jìn)行了標(biāo)記，通過(guò)FTIR，UV以及HPGPC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。利通激光總聚焦顯微鏡直觀考察了CPA能否入胞，采用流式細(xì)胞儀考察了CPA的入胞特點(diǎn)，并進(jìn)行了入胞機(jī)制的研究；最后在小鼠體內(nèi)考察了CPA的藥代動(dòng)力學(xué)特征以及組織分布特點(diǎn)。本研究提供了CPA內(nèi)化和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)理論知識(shí)，為黨參多糖的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。該研究成果于2022年8月31日在《International Journal of Biological Macromolecules》（IF=8.02）上以“Investigation of the internalization and transport mechanism of Codonopsis Radix polysaccharide both in mice and Caco-2 cells”為題在線發(fā)表。
該研究結(jié)果顯示：
1. 本部分研究探討了FCPA的入胞機(jī)制，分別用巨胞飲、小窩蛋白依賴性、網(wǎng)格蛋白依賴性、網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴性抑制劑抑制相關(guān)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F-NH-CPA主要通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴性途徑進(jìn)入細(xì)胞；使用溶酶體、微管蛋白抑制劑后，F-NH-CPA的胞內(nèi)攝取量減少，表明溶酶體、微管蛋白參與了F-NH-CPA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。
圖1 FCPA的入胞特點(diǎn)
2.本部分研究模擬腸上皮細(xì)胞構(gòu)建了Caco-2單層細(xì)胞模型，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直觀考察CPA的胞內(nèi)攝。⑼ü魘較赴墻卸糠治。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有FCPA的熒光信號(hào)，表明FCPA可以被吸收進(jìn)入細(xì)胞；進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀進(jìn)行半定量研究，發(fā)現(xiàn)FCPA進(jìn)入細(xì)胞具有時(shí)間、濃度依賴性。用Transwell小板構(gòu)建的Caco-2單層細(xì)胞明確FCPA的攝取能力，結(jié)果表明FCPA吸收較差，只有較少的FCPA能進(jìn)入細(xì)胞。
圖2 FCPA的入胞機(jī)制
3. FCPA可以吸收入血，達(dá)峰時(shí)間較快，約為1 h，且在6 h出現(xiàn)了雙峰。T1/2較短，為5.39 ± 1.73 h，CL/F為5.73 ± 3.09 L h-1 kg-1；平均滯留時(shí)間MRT為9.44 ± 2.73，其表觀分布容積Vd/F為41.89 ± 12.42 L kg-1，藥時(shí)曲線下面積AUC(0→∞)為11.36 ± 3.80 mg L-1 h-1，表明FCPA在小鼠體內(nèi)分布廣泛，滯留時(shí)間較長(zhǎng)，消除較慢，不能迅速轉(zhuǎn)移到外周組織或隨尿液排出。FCPA可廣泛分布到肝、腎、肺、胃、腸道等組織，組織濃度相當(dāng)或者略高于同時(shí)間點(diǎn)血漿濃度，但整體濃度較低。
圖3 FCPA的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布研究
藥學(xué)院高建平教授為本文的通訊作者，藥學(xué)院2019級(jí)博士研究生邵云云為本文的第一作者。該研究項(xiàng)目得到國(guó)家重大專項(xiàng)（2019YFC1710800 and 2019YFC1710801）的資助。
