段金菊課題組揭示亞抑菌濃度和耐藥突變窗內濃度的環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌毒力因子和耐藥性的不同影響及rhlR和pqsR基因的表達量與泳動能力存在中等程度的正相關關系
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一種條件致病菌，常引起嚴重的急慢性感染。它主要感染免疫缺陷的宿主，如患囊性纖維化肺病、嚴重燒傷、留置醫療設備等的患者。銅綠假單胞菌引起的急性感染主要包括侵襲、擴散和廣泛的組織損傷。在這一階段，自身產生的毒力因子的活性起重要作用。毒力因子活性越高，感染癥狀越嚴重，甚至使感染更難治療。銅綠假單胞菌在急性感染期產生的毒力因子包括:泳動能力、群集運動、彈性蛋白酶、綠膿菌素、鼠李糖脂等。其中泳動能力可促進銅綠假單胞菌對表面的附著和對宿主其他部位的侵襲，從而使感染部位擴大，感染程度加重。近年來的研究表明，銅綠假單胞菌的某些極性細胞器，包括IV型菌毛、極性菌毛和鞭毛等介導了泳動能力。
銅綠假單胞菌感染可由急性期向慢性期轉變。這種轉變是細菌細胞生理對外界刺激的反應。在慢性感染階段，大多數毒力因子活性降低，而采用細菌生物膜生活方式作為毒力因子。生物膜的形成促進了難治性感染和多藥耐藥的發展。
環丙沙星（CIP）是治療銅綠假單胞菌感染的重要抗菌藥物。已有研究報道，CIP的亞抑菌濃度(sub-MIC)影響銅綠假單胞菌的毒力因子活性和抗性突變體的選擇。然而，在敏感銅綠假單胞菌感染的臨床治療中，CIP的治療濃度往往不是亞抑菌濃度，而是高于最低抑菌濃度(MIC)，低于防突變濃度(MPC)，即落入耐藥突變窗內(MSW)。在這個濃度范圍內，可以殺死敏感菌，但也可以選擇耐藥菌株生長。這可能使治療更加困難，甚至導致治療失敗。然而，關于耐藥突變窗內濃度對毒力因子活性影響的研究較少。因此，我們用耐藥突變窗內濃度和亞抑菌濃度的環丙沙星分別誘導銅綠假單胞菌，探討不同濃度對MIC、泳動能力和生物膜形成的影響。同時有研究表明，急性毒力因子受細菌細胞間通信機制-群體感應系統的調控（quorum sensing system）。因此，我們還探討了泳動能力與lasI、lasR、rhlI、rhlR和pqsR基因表達的相關性。
該研究的主要發現有：
1.環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌最低抑菌濃度的影響。
結果表明，在亞抑菌濃度(0.5×MIC)下(圖1A)，隨時間的延長，銅綠假單胞菌對CIP的MIC呈上升趨勢(P=0.001)。與亞抑菌濃度(0.5×MIC)相比(圖1b)，第5天MSW內濃度(1×MIC、2×MIC、4×MIC)能更明顯的促進MIC值的增加(P<0.05)。
圖1在誘導過程中銅綠假單胞菌對環丙沙星的MIC 值的變化
A:在四種濃度下MIC值的變化趨勢。
B:亞抑菌濃度(0.5×MIC)和MSW內濃度(1×MIC、2×MIC、4×MIC)下，MIC值的變化趨勢。
Sum:不考慮誘導濃度的影響，MSW內濃度下MIC的均值。
進一步分析發現，在各濃度下(圖2)，MIC隨時間的延長其增量顯著增加(P<0.05)。尤其是在4×MIC濃度下的MIC增量高于其余三個濃度下的MIC增量。
圖2單效應分析在誘導過程中MIC 的變化
1/0, 3/0, 5/0:在第1、3、5天的MIC值除以原始MIC值，表示第1、3、5天MIC值的增量。
*:在此濃度下，MIC 的增量明顯上升(P<0.05)。
#:在第3、5天，不考慮誘導濃度的影響時，MIC值的增量顯著增加(P<0.05)。
2.環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌泳動能力的影響。
研究結果顯示（圖3）在亞抑菌濃度下，隨誘導時間的延長，泳動能力呈現先抑制后促進的趨勢(P<0.05)，尤其是第五天。而在耐藥突變窗內濃度下，泳動能力呈現持續促進的趨勢(P<0.05)。此外，與4×MIC濃度相比(圖3D)，第5天0.5×MIC對游泳運動的促進作用更明顯(P<0.05)
圖3環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌泳動能力的影響
A:泳動能力變化的整體趨勢。
B: 0.5×MIC濃度下，泳動能力的變化趨勢。
C: 1×MIC, 2×MIC and 4×MIC ( MSW內濃度)下，泳動能力的變化趨勢。
D: 0.5×MIC濃度和MSW內濃度對泳動能力影響的比較。
Sum:不考慮誘導濃度，泳動能力的的均值。
3.環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌生物膜的影響。
如圖4所示，在0.5×MIC濃度下，生物膜形成能力隨時間的變化趨勢無統計學差異(P>0.05)。即在0.5×MIC濃度下，CIP誘導對生物膜形成能力的影響隨時間變化不明顯。但我們仍然可以發現，在第一天，生物膜的形成能力得到了促進。而在第三天和第五天，生物膜形成能力則被持續抑制。
進一步分析表明，在4×MIC濃度下，CIP誘導對生物膜形成能力的影響隨時間的變化有顯著性差異(P<0.05)。在此濃度下，生物膜形成能力在第3天被明顯促進，而在第5天又恢復到較低水平。
圖4環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響。
*:在此濃度下，隨時間的延長，生物膜形成能力被顯著促進(P<0.05)。
4.環丙沙星誘導對銅綠假單胞菌群體感應系統基因的影響。
如表1、2所示，在亞抑菌濃度下，CIP誘導對各基因表達量的影響隨時間變化不顯著(P>0.05)，但仍有上升的趨勢。在1×MIC、2×MIC、4×MIC濃度下，各基因的表達量隨時間相同程度的上調。
表1 亞抑菌濃度下環丙沙星誘導對基因表達量變化的影響
Concentration (?g/ml) |
Gene |
Time(day) |
Sum |
1 |
3 |
5 |
0.5×MIC |
lasI |
1.06±0.58 |
1.36±0.88 |
1.10±0.83 |
1.17±0.71 |
lasR |
0.89±0.29 |
1.30±1.16 |
1.10±1.22 |
1.10±0.91 |
rhlI |
0.87±0.57 |
1.05±0.86 |
0.96±0.99 |
0.96±0.75 |
rhlR |
1.24±1.78 |
2.48±2.54 |
2.08±1.51 |
1.93±1.88 |
pqsR |
0.80±0.40 |
0.97±0.30 |
1.40±1.02 |
1.06±0.65 |
表2 亞抑菌濃度下環丙沙星誘導對基因表達量變化的影響
Concentration (?g/ml) |
Gene |
Time(day) |
Sum |
1 |
3 |
5 |
1×MIC |
lasI |
0.83±0.33 |
1.50±0.60 |
1.21±0.43 |
1.18±0.51 |
lasR |
0.58±0.20 |
1.28±1.15 |
1.06±0.96 |
0.97±0.85 |
rhlI |
0.70±0.23 |
1.26±0.83 |
1.18±0.56 |
1.05±0.60 |
rhlR |
1.04±0.88 |
1.45±0.57 |
3.58±4.26 |
2.02±2.56 |
pqsR |
0.78±0.66 |
1.28±0.65 |
1.19±0.95 |
1.09±0.73 |
2×MIC |
lasI |
0.66±0.31 |
1.70±1.03 |
1.61±1.37 |
1.32±1.03 |
lasR |
0.64±0.24 |
1.46±0.92 |
2.17±2.52 |
1.42±1.55 |
rhlI |
0.47±0.41 |
1.46±1.23 |
1.45±1.49 |
1.13±1.14 |
rhlR |
1.71±2.45 |
2.94±2.48 |
3.74±5.45 |
2.79±3.49 |
pqsR |
0.72±0.34 |
1.09±0.76 |
1.71±2.30 |
1.17±1.35 |
4×MIC |
lasI |
0.71±0.24 |
1.19±0.46 |
2.09±1.18 |
1.33±0.90 |
lasR |
0.74±0.27 |
1.21±0.68 |
2.05±1.48 |
1.34±1.03 |
rhlI |
0.66±0.25 |
0.92±0.37 |
1.81±1.34 |
1.13±0.90 |
rhlR |
1.13±0.70 |
2.85±2.33 |
2.61±0.87 |
2.20±1.57 |
pqsR |
0.72±0.54 |
0.83±0.72 |
1.85±1.77 |
1.13±1.16 |
Sum# |
lasI* |
0.73±0.28 |
1.46±0.70 |
1.64±1.04 |
1.42±1.31 |
lasR* |
0.65±0.29 |
1.32±0.85 |
1.76±1.69 |
rhlI* |
0.61±0.30 |
1.21±0.83 |
1.48±1.12 |
rhlR |
1.29±1.44 |
2.41±1.94 |
3.31±3.68 |
pqsR |
0.74±0.48 |
1.07±0.67 |
1.58±1.62 |
四種濃度下lasI、lasR、rhlI、rhlR和pqsR基因表達與泳動能力的相關性結果見表3。在亞抑菌濃度下，rhlR和pqsR基因表達與泳動能力的促進呈中等水平正相關關系(P<0.05, r=0.788, P<0.05, r=0.652)。
表3 不同濃度下基因表達量與泳動能力的相關性
Phenotype |
Concentration (?g/ml) |
Correlation |
Insignificant negative correlation |
Insignificant positive correlation |
Low level positive correlation (0.3≤|r|＜0.5) |
Middle level positive correlation (0.5≤|r|＜0.8) |
Swimming motility |
sub-MIC |
— |
lasI, lasR, rhlI |
— |
rhlR. pqsR |
MSW |
lasI, rhlR. pqsR |
lasR, rhlI |
— |
— |
r:相關系數
獨特的誘導方案以及特別的統計方法（重復測量方差分析），使得本研究結果更加可信。同時，本研究所得結果對臨床建立合理使用抗菌藥物治療銅綠假單胞菌的感染以及控制銅綠假單胞菌對環丙沙星的耐藥性具有重要的參考價值。
c7c7.app藥學院史楠為本文第一作者，c7c7.app第二醫院藥學部副主任段金菊為本文通信作者。本項目得到山西省科技廳省自然科學基金的支持。
